样品处理
1．如果是新收集的细胞，须用1×PBS洗涤2次，4-20℃，1600-3000 rpm，3 min。最后一次将上清吸走。如果是冻存于-80℃的细胞，可直接取出放置在冰上备用。
2．按如下方法进行操作：
收集的细胞或组织，加入适量RIPA裂解液[货号：PC101、PC102、PC103、PC104]（在使用前数分钟内按1：100加入蛋白酶抑制剂[货号：GRF101]，如需研究磷酸化蛋白需要额外加入磷酸酶抑制剂[货号：GRF102]），涡旋振荡数秒，冰上放置30 min，间或振荡，直至充分裂解，高速低温离心（4℃，12000 g，15 min），将上清液转移到无菌离心管中备用（如蛋白不能及时使用，可以冻存于-80℃保存）。
3．每孔加入蛋白液/标准品20μL。将试剂蛋白定量试剂盒 A液:B液（50:1）配比混匀后，加入200μL至每孔。37℃烘箱中孵育30分钟或室温1小时。放置到酶标仪中测浓度【single wavelength 562nm】r2大于0.99为最好结果。测好浓度的蛋白分装放于-80℃保存。
BCA蛋白定量试剂盒[货号：ZJ101]和Bradford蛋白定量试剂盒[货号：ZJ102]。使用RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到的样品的蛋白浓度。
将BSA标准品用PBS稀释成一系列浓度梯度：
|
Vial |
Volume of Diluent |
Volume and source of BSA |
Final BSA Concentration |
|
A |
0 |
300μL of Stock |
2000μg/mL |
|
B |
125 |
375μL of Stock |
1500μg/mL |
|
C |
325 |
325μL of Stock |
1000μg/mL |
|
D |
175 |
175μL of vial B dilution |
750μg/mL |
|
E |
325 |
325μL of vial C dilution |
500μg/mL |
|
F |
325 |
325μL of vial E dilution |
250μg/mL |
|
G |
325 |
325μL of vial F dilution |
125μg/mL |
|
H |
400 |
100μL of vial G dilution |
25μg/mL |
|
I |
400 |
0 |
0μg/mL=Blank |
配胶
1.将测好浓度的蛋白液与上样缓冲液[货号：LT102、LT101]一起混匀后，放入100℃水浴5-6 min。离心，放置冰上，待上样。（Tips：煮过的样品可以在-20℃条件下长期保存）
2.配制PAGE胶[货号：PG110，PG111，PG112，PG113，PG114]。
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6% |
8% |
10% |
12% |
15% |
|
Water |
5.4 |
4.7 |
4.1 |
3.4 |
2.4 |
|
Bis/Acryl. 30% |
2.0 |
2.7 |
3.3 |
4.0 |
5.0 |
|
4×Tris.HCl/ SDS (1.5M, pH 8.8) |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
|
10% Ammonium persulfate |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
TEMED |
0.008 |
0.008 |
0.008 |
0.008 |
0.008 |
|
Total volume |
10 ml |
10 ml |
10 ml |
10 ml |
10 ml |
3.按上表顺序加各溶液配制不同浓度的下层胶，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，用异丙醇或水封平。待下层胶凝固后，将封平液倒干净，开始配制下层胶。
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Water |
2.87 |
|
Bis/Acryl. 30% |
0.83 |
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4×Tris.HCl/ SDS (0.5M, pH 6.8) |
1.25 |
|
10% ammonim persulfate |
0.05 |
|
TEMED |
0.005 |
|
Total volume |
5.0 ml |
按顺序加各溶液，混匀好，加入两块制胶玻璃板中，不要有气泡，立即将梳子插入，凝固后将梳子拔出。
将制好的胶装入电泳槽，倒入电泳缓冲液[货号：PS105]，开始上样，每个孔上样1-40 μL（根据胶的厚度以及实验要求决定上样量）。记录上样次序，点Marker [货号：WJ101，WJ102]。
